Afinitná chromatografia.

Podstatou afinitnej chromatografie je schopnosť biologicky aktívnych látok 

           vytvárať špecifický, stabilný ale reverzibilný komplex s inou molekulou.

(pr.enzým-inhibítor, antigén-protilátka, komplementárne vlákna nukleových kyselín)

Princíp naviazania  látky zo vzorky:

- špecifická látka = ligand sa naviaže na častice nosiča (nosiče z gél.chromatografie)

- zo zmesi látok s ligandom reaguje len jedna látka na základe jedinečnej,  špecifickej

   interakcie

- po vymytí nezachytených látok sa  oddelená látka eluuje (uvoľní z väzby) pomocou:

§      zmeny teploty (čím vyššia teplota, tým slabšie väzby)

§      zmeny pH

§      zmeny iónovej sily

§      prídavkom deformujúcich činidiel (močovina mení štruktúru bielkovín)

§      zmenou  polarity roztoku (etylénglykol znižuje polaritu)

Postup, zariadenia a aplikácia vzorky:

1. naviazanie = imobilizácia  ligandu na častice nosiča

Matrica nosiča sa aktivuje napr. reakciou s CNBr, divinylsulfónom, karboimidom.

                       -OH    + CNBr                     -O-C=N

                  nosič                                                       aktivovaný nosič

Na aktivovaný nosič sa imobilizuje ligand.

                       -O-C=N  + H₂N--R                 -O-C-NH--R

                                         ligand                         NH  

                                                                                                afinitný nosič

Nenaviazaný ligand sa odstráni premytím nosiča tlmivým roztokom.

- priestorové predpoklady na naviazanie látky zlepšuje  tzv. ramienko,

  oddiali ligand od častice nosiča do priestoru a umožní lepšiu väzbu látky na ligand

       vsádkový spôsob

       kolónový spôsob

Vzorka sa aplikuje rozpustená v tlmivom roztoku.

Premytie systému tlmivým roztokov v objeme = 10-násobku objemu nosiča.

Elúcia zachytenej látky v kolóne pri prietoku max. 10 ml/cm² náplne za 1 hodinu.

Detekcia eluátu: ako pri gélovej chromatografii.

Aplikácie:

- izolácia veľmi čistých enzýmov, koenzýmov,  protilátok, nukleových kyselín

- izolácia vírusov

Komerčné nosiče - len výnimočne: tzv. skupinové nosiče, napr. ligand heparín pre lipázy alebo  restrikčné endonukleázy, ligand concanavalin pre glykoproteíny alebo glykolipidy.

Výber ligandu - empiricky.