ELEKTROFORÉZA

je pohyb  elektricky nabitých častíc vo viskóznom

                                 prostredí, v kvapaline alebo v géli, k opačne nabitým

                                 elektródam.

- anióny sa pohybujú k anóde, katióny sa pohybujú ku katóde            

  elektroforéza s pohyblivým rozhraním = voľná elektroforéza

                     zónová elektroforéza  

Voľná elektroforéza (Tiselius, 1937).

-  látky migrujú vo voľnom roztoku

- technické zariadenie:  sklenená trubica tvaru "U"

Postup:

- vzorka sa aplikuje na dno trubice a prevrství sa tlmivým roztokom

- do ramien trubice sa vložia elektródy  a po zapnutí el. prúdu dochádza  k pohybu

  zložiek zmesi

- vytvoria sa rozhrania jednotlivých látok, ktoré nie sú dokonale priestorovo oddelené

- detekcia meraním indexu lomu svetla

Nevýhody:

Ÿ         nie presné  oddelenie jednotlivých zón, výnimkou najrýchlejšej a najpomalšej látky

Napr. zo zmesi látok A+B+C+D sa ako čisté získajú len A a D , pretože sa vytvoria rozhrania: elektrolyt---látka A---A+B+C+D---B+C+D---C+D---D---elektrolyt

Ÿ         problematická izolácia oddelených látok

Ÿ         nízka rozlišovacia schopnosť 

Ÿ         konštrukčne náročné zariadenie

Zónová elektroforéza.

- pohyb látok v prostredí stabilizačného nosiča - porézny materiál (papier,  tenká

  vrstva celulózy) alebo gél (škrob, agaróza, polyakrylamid)

- nosič je navlhčený tlmivým roztokom

- pohyb trvá tak dlho, kým sa látky úplne neoddelia a vytvoria zóny

Ø      na inertnom a homogénnom nosiči sa látky delia len podľa veľkosti veličiny náboj/hmotnosť molekuly

Ø      na nosiči, ktorý reaguje s delenými látkami  sa látky delia  aj na základe veľkosti

      a tvaru molekúl (=schopnosti prechádzať pórmi nosiča)

Pohyblivosť el. nabitých častíc v elektrickom poli ovplyvňuje:

1. vlastnosti vzorky:

celkový náboj - so zväčšovaním náboja látky narastá jej pohyblivosť

                         - čím väčší náboj majú molekuly látky, tým rýchlejšie sa pohybujú

                         ! amfolyty menia náboj zmenou pH prostredia!

veľkosť molekuly- čím je molekula väčšia, tým pomalšie sa pohybuje

tvar - globulárne látky sa pohybujú  rýchlejšie ako fibrilárne látky

2. vlastnosti elektrického poľa:

                                      U

Ohmov zákon          I =                    I - intenzita el. prúdu

                                      R               U - napätie

                                                        R-odpor

intenzita el. prúdu - rýchlosť pohybu je priamoúmerná intenzite el. prúdu

                               - vzdialenosť, ktorú migrujúca častica prejde je úmerná dobe

                                                      prechodu prúdu cez roztok elektrolytu

- pre reprodukovateľné delenie je nevyhnutné udržiavať el. prúd konštantný

napätie -  rýchlosť pohybu je úmerná potenciálovému spádu

                potenciálový spád je úbytok napätia ne jednotku dĺžky nosiča [V.cm^-1]                

Napätie 100 - 500 V.

Potenciálový spád  menej  ako 20 V/cm ...nízkovoltová elfo

                                od 20 do 50 V/cm ......strednevoltová elfo

                                nad 50 V/cm ..............vysokovoltová elfo

                                                                     konštantný  jednosmerný el. prúd

Podľa zvolenej metódy elfo sa využíva            alebo

                                                                     konštantné napätie

odpor - zväčšuje sa s narastaním dĺžky nosiča

           - zmenšuje sa so zväčšením prierezu nosiča

Prechodom el. prúdu vzniká teplo,

ktoré je priamoúmerné intenzite prúdu a odporu    Q = I².R

                                                                                                                   U².t

ktoré je priamoúmerné napätiu a času a nepriamoúmerné odporu   Q =                                                     

                                                                                                                 R

- zníženie odporu (= zvýšenie vodivosti 1/R) pri konštantnom napätí vedie k zvýšenie

  prúdu a produkcii tepla

- čím je väčšia vodivosť, tým je väčšie teplo          zvyšuje sa teplota systému,

  elektrolyt  sa odparuje, zahusťuje            zväčší sa vodivosť ....

Preto: vzduchotesné uzatvorenie elektroforetickej aparatúry

           intenzívne chladenie celého systému

           zníženie koncentrácie  elektrolytických roztokov

           zníženie napätia, zníženie potenciálového spádu

3. vlastnosti prostredia:

 presne definovaná teplota

 zloženie elektrolytických roztokov -  tlmivé roztoky s presnou koncentráciou

                                                               a hodnotou pH

- zvýšená koncentrácia elektrolytu zvýši podiel el. prúdu preneseného roztokom

                                                       a zníži podiel el. prúdu preneseného vzorkou

- v roztoku s nízkou koncentráciu vzrastá difúzia

Preto: konc. 0,01 - 0,10 mol.dm^-3

pH určuje stupeň disociácie organických molekúl

Vplyv pH na amfolyty (aminokyseliny, bielkoviny):

                                 OH^-                                     OH^-

H₃N⁺ -CH(R)-COOH           H₃N⁺ -CH(R)-COO^-           H₂N -CH(R)-COO^-

                                    H⁺                                                         H⁺

         kyslé pH                        izoelektrický bod                zásadité pH

            pohyb ku katóde                    bez pohybu                pohyb ku anóde

4. vlastnosti nosiča:

- pohyblivosť na nosičoch je menšia ako pri voľnej elektroforéze

adsorpcia - zadržiava delené molekuly

                  - prejavuje sa najmä pri elfo na papieri = "chvostovanie zón"

efekt molekulového sita - pohyb látky je určovaný aj štruktúrou, poréznosťou častíc

                                            nosiča

Elfo v polyakrylamide, v škrobe, v agaróze: čím väčšie molekuly, tým pomalší pohyb

Elfo v dextráne (Sephadex): čím väčšie molekuly, tým rýchlejší pohyb