Elektroforéza v polyakrylamidových géloch (PAGE).

-  delenie podľa veľkosti náboja a podľa veľkosti molekúl

- možnosť rozdeliť látky s rovnakým nábojom, ale rôznou veľkosťou molekúl

Výhody:

ľahká príprava gélu

jednoznačné, presne definované zloženie gélu

definovaná veľkosť pórov

výborné mechanické vlastnosti gélu

priesvitnosť = umožňuje denzitometrické vyhodnotenie

nízka adsorpcia látok

gél je chemicky inertný

najväčšia rozlišovacia kapacita

Nevýhoda:

toxicita monomérov pre prípravy gélu

Polyakrylamid sa pripravuje polymerizáciou akrylamidu (H₂C=CH-CONH₂)

a N,N´-metylénbisakrylamidu (H₂C=CH-CO-NH-CH₂-NH-CO-CH=CH₂).

Polymerizácia sa iniciuje svetlom alebo chemicky napr. persíranom amónnym 

a tetrametyléndiamínom (TEMED).

Veľkosť pórov gélu je nepriamoúmerná koncentrácii akrylamidu:

             % akrylamidu                    M_r delených látok

                  15 -30                          menej ako 10 000

                      12                              10 000 - 90 000  

                      7,5                             30 000 - 150 000

                       4                               90 000 - 1 000 000

Postup: 

- gél sa pripravuje vo forme valčekov v sklených trubičkách o priemere 5 - 6 mm a

  dĺžke 6 - 8 cm  alebo vo forme platní o hrúbke 0,5 -2,5 mm.

- pre aplikáciu vzorky sa na začiatku polyakrylamidového gélu pripraví tzv.

  štartovací gél (s prídavkom agarózy), do ktorého sa pri platňovom usporiadaní

  vkladá "hrebeň" (vytvoria sa tak miesta pre nanášanie vzoriek)

Detekcia:

denzitometricky (bielkoviny 280 nm, nukl. kyseliny 260 nm)

fixácia (kys. trichlóroctová) a farbenie (bielkoviny Amidočerň 10B,  Coomassie Briliant    

                                                             Blue R 250, nukl. kyseliny sa farbia striebrom)

Konvenčná PAGE: homogénny gél, delenie látok podľa veľkosti náboja a veľkosti

                               molekúl

PAGE , pri ktorej sa látky delia len podľa veľkosti molekúl je

Ÿ         PAGE v gradientovom géli: napr. s plynule sa zmenšujúcou veľkosťou pórov

- v určitom mieste sa gél stáva neprechodný pre určitú veľkosť molekúl

Ÿ         PAGE v prostredí dodecyl síranu sodného = SDS-PAGE:

      bielkoviny sa pred elfo denaturujú v SDS s prídavkom tiolového činidla (napr. 2-

      merkaptoetanol). Rozštiepia sa disulfidické väzby a SDS sa viaže v množstve

     1,4g na gram bielkoviny.  Bielkovina získa záporný náboj  a tak sa pôvodné

     náboje neprejavia. Bielkoviny sa delia na základe rozdielnych veľkostí molekúl.

Ideálna metóda na stanovenie molekulovej hmotnosti bielkovín.