Molekulová vylučovacia chromatografia.

- separačná chromatografická metóda, pri ktorej sa látky delia pomocou

  pórovitých gélov podľa veľkosti molekúl

Gélová filtračná chromatografia - hydrofilný gél a vodný elučný roztok

Gélová permeačná chromatografia - hydrofóbny gél a organické rozpúšťadlo

Gélová filtrácia.

- stacionárna fáza je zakotvená v časticiach gélu, ktoré majú póry

- gélom sa naplní chromatografická kolóna (alebo sa pripraví tenká vrstva)

Princíp delenia:

·        Na povrch gélu sa aplikuje vzorka (obsahuje látky s rôzne veľkými molekulami)

     a premýva sa elučným roztokom = rovnakým ako je roztok v časticiach gélu.

·        Molekuly väčšie ako sú póry gélu nemôžu preniknúť do častíc gélu a len ich obtekajú rýchlosťou, ktorá je rovnaká ako rýchlosť toku elučného roztoku.

·        Z chromatografickej kolóny vytekajú ako prvé najväčšie molekuly.

·        Molekuly menšie ako sú póry gélu prenikajú do častíc gélu a sú tak zadržiavané.

·        Rôznou rýchlosťou difúzie sa z častíc dostávajú von a z chromatografickej kolóny vytekajú neskôr. Látky sa eluujú v poradí, ktoré určuje zmenšujúca sa veľkosť molekúl.

·        Z chromatografickej kolóny vytekajú ako posledné najmenšie molekuly.

Základné charakteristiky = Elučné dáta:

Celkový objem stĺpca gélu    V_t = V₀ + V_S +  V_X

 V₀  je vonkajší objem = objem medzi časticami gélu

 V_S  je objem stacionárnej fázy = objem kvapaliny v časticiach gélu

 V_X  je objem gélovej matrice = objem gél. častíc bez stacionárnej fázy

Elučný objem   V_e = V₀ + K_D.V_S

K_D   je rozdeľovací koeficient          

·        pre veľké molekuly   je K_D = 0    Þ  V_e = V₀

_·          pre malé molekuly   je K_D  = 1    Þ  V_e = V₀ + V_S

Chromatogram = elučná krivka:

                             veľké molekuly     

                                                                                        malé molekuly

                                                        stredné m.

                       I                                                            I

                      V₀                                                                                      V_t

                                I                                                            I

                                 0                                                                          1                    K_D

Nosiče = náplne:

- prírodné alebo syntetické pórovité gély

Charakterizované sú frakcionačným rozsahom = rozsah molekulových hmotností.

Molekuly s hmotnosťou väčšou ako je horná hranica rozsahu (vylučovací limit)  sa neoddelia. Eluované sú v objeme V₀.

Gély sú tuhé látky, pred použitím musia napučiavať v destil. vode a potom sa "ekvilibrovať"  = premývať  elučným roztokom.

Požiadavky na gél:

·        inertný pre delené látky aj pre mobilnú fázu

·        dlhodobá chemická stabilita, stabilita voči zmenám pH, tlaku a teploty

·        dobrá mechanická stabilita (menšie póry sú stabilnejšie ako väčšie póry)

·        presne definovaná veľkosť častíc

·        široký výber rôzne pórovitých gélov tej istej chemickej podstaty

SACHARIDOVÉ NOSIČE:

- z dextránu: Sephadex G 10, G25, .....G200

               pre gélovú filtráciu

                     10-násobok objemu vody, ktorú nasaje 1g suchého gélu pri napučiavaní

                     Veľkosť častíc gélu: superfine   najmenšie  (10 - 40mm)

                                                               fine                     (20 - 80mm)

                                                         medium                    (50 - 150mm)

                                                         coarse    najväčšie   (100 - 300mm)

- z agarózy: Sepharose 2B, 4B, 6B

- POLOSYNTETICKÉ: Sephacryl (dextrán + akrylamid)

- SYNTETICKÉ aerogély: pórovité sklo, Bio-Gel