Spektrofotometria: (Optické metódy v biochémií)

22.06.2012 19:24

 

Spektrofotometria:

- meria sa  intenzita zoslabeného  monochromatického žiarenia po prechode vzorkou

 

Základné zariadenie:

zdroj žiarenia            monochromátor           vzorka           detektor

pre UV: deutériová výbojka               v kyvete z kremenného skla

pre VID: volfrámová lampa

              halogénová lampa

 

                              optické hranoly a mriežky                        fotonásobič

 

 

Praktické využitie:

Ÿ         pre neznáme látky je potrebné zmerať celé absorpčné spektrum

Ÿ         jednorázové meranie absorbancie je vždy pri vlnovej dĺžke absorpčného maxima

Ÿ         z roztokov o známej koncentrácii sa pripravujú kalibračné grafy

Ÿ        referenčným roztokom (nastavenie prístroja, pozadie...) je vždy čisté rozpúšťadlo

 

Stanovenie koncentrácie bielkovín:

 

Metóda podľa Whitakera a Granuma:   [A235 -  A280] :2,51 . riedenie =       mg/ml

                                                                 

Metóda podľa Laynea:           1,55.A280 - 0,76.A260 =          mg/ml

 

Stanovenie pomocou kalibračných roztokov:  podľa Lowryho alebo podľa Bradforda

 

 

Kolorimetria:

- porovnávanie intenzity zafarbenia farebných roztokov so štandardnými roztokmi

     Platí Beerov zákon:      c1.d1 = c2.d2                          c1 - meraná koncentrácia látky           

                                                                             d1 - hrúbka vrstvy vzorky           

                                                                             c2 - koncentrácia štandardu          

                                                                             d- hrúbka vrstvy štandardu         

 

Nepresná metóda, chyba pri stanovení ± 5 - 20%